Categorii
Adult69

Dovezi pentru pierderea si reincadrarea fermentatiei alcoolice intr-o linie de drojdie fructofila

Abstract

Fructofilia este o trasatura rara care consta in preferinta pentru fructoza fata de alte surse de carbon. Aici, ne arata ca intr – o filiatie de drojdie (The Wickerhamiella / Starmerella, Clasa W / S) cuprinsa din specii fructofile care prosperau in nisa florala cu un nivel ridicat de zahar, achizitia fructofiliei este concomitenta cu o remodelare mai larga a metabolismului carbonului central. Cupland genomica comparativa cu abordarile biochimice si genetice, am adunat dovezi suficiente pentru pierderea fermentatiei alcoolice la un stramos al cladei W / S si restabilirea ulterioara, fie prin achizitia orizontala a genelor bacteriene omoloage, fie prin modificarea unei gene drojdii preexistente. O enzima necesara pentru asimilarea zaharozei a fost de asemenea dobandita din bacterii, ceea ce sugereaza ca noutatile genetice identificate in clada W / S pot fi legate de adaptarea la mediul cu continut ridicat de zahar. Aceasta lucrare arata cum chiar si metabolismul central al carbonului poate fi remodelat de o crestere a evenimentelor HGT.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.001

eLife digera

Celulele isi construiesc componentele, cum ar fi utilajul molecular care ii ajuta sa obtina energie din mediul lor, urmand instructiunile continute de gene. Aceste informatii genetice sunt de obicei transferate de la parinti la urmasi. De-a lungul mai multor generatii, genele pot acumula mici schimbari, iar moleculele pe care le codifica pot dobandi noi roluri: totusi, acest proces este in mod lent. Cu toate acestea, anumite organisme pot obtine, de asemenea, gene complet noi, prin „furtul” lor de la alte specii. De exemplu, drojdiile, precum cele folosite la fabricarea painii si berii, pot lua gene din bacteriile din apropiere. Acest „transfer orizontal de gene” ajuta organismele sa dobandeasca rapid noi caracteristici, ceea ce este deosebit de util daca mediul se schimba rapid.

Un mod prin care drojdiile capata energia de care au nevoie este descompunerea zaharurilor printr-un proces numit fermentare alcoolica. Pentru a face acest lucru, majoritatea speciilor de drojdie prefera sa utilizeze un zahar numit glucoza, dar un grup mic de specii „fructofile” favorizeaza in schimb un tip de zahar cunoscut sub numele de fructoza. Oamenii de stiinta nu stiu exact cum au ajuns drojdiile fructofile, dar exista unele dovezi care s-ar fi putut implica transferuri de gene orizontale.

Acum, Goncalves si colab. au comparat materialul genetic al drojdilor fructofile cu cel al altor grupe de drojdii. Compararea materialului genetic ii ajuta pe oamenii de stiinta sa identifice asemanarile si diferentele dintre specii si ofera indicii despre motivul pentru care au evoluat pentru prima data trasaturile genetice specifice.

Experimentele arata ca, la inceputul istoriei lor, drojdiile fructofile au pierdut genele care le-au permis sa faca fermentatia alcoolica, probabil din moment ce puteau obtine energie intr-un mod diferit. Cu toate acestea, la un moment mai tarziu, aceste drojdii au trebuit sa se adapteze pentru a supravietui in nectarul de flori, un mediu bogat in zahar. Apoi au favorizat fructoza ca sursa a lor de energie, posibil pentru ca acest zahar poate compensa mai eficient absenta fermentatiei alcoolice. Ulterior, drojdiile au dobandit o gena din bacteriile din apropiere, ceea ce le-a permis sa faca din nou fermentatia alcoolica: acest lucru a imbunatatit capacitatea lor de a folosi celelalte zaharuri prezente in nectarele de flori.

La obtinerea de energie, drojdiile si alte organisme produc substante relevante pentru industrie. Studierea proceselor naturale de evolutie poate ajuta oamenii de stiinta sa inteleaga modul in care organismele pot schimba modul in care isi obtin energia si se pot adapta la noile provocari. La randul sau, acest lucru ajuta la inginerii drojdiilor in „fabrici de celule” care produc substante chimice valoroase in moduri ecologice si rentabile.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.002

Introducere

Genomica comparativa este un instrument puternic pentru descoperirea legaturilor dintre fenotipuri si genotipuri intr-un cadru evolutiv. Desi au fost observate progrese extraordinare in acest sens in toate domeniile vietii, analizele numarului in crestere rapida a genomilor fungici disponibili au fost deosebit de utile pentru a evidentia aspecte importante ale genomelor eucariote, inclusiv un domeniu mai larg de mecanisme evolutive decat pana acum s-a considerat probabil. . De exemplu, se considera ca transferurile de gene orizontale (HGT) au jucat un rol foarte important in domesticire (Gibbons et al., 2012; Marsit si colab., 2015; Ropars et al., 2015) si in evolutia metabolismului la ciuperci. (Alexander si colab., 2016; Wisecaver and Rokas, 2015). Cazurile din urma sunt prezentate cel mai bine de frecventa ridicata a evenimentelor HGT care implica grupuri de gene legate de metabolismul primar si secundar fungic (Campbell si colab., 2012; Khaldi si Wolfe, 2011; Slot si Rokas, 2010; 2011; Wisecaver si Rokas, 2015). Atunci cand luam in considerare transferul orizontal al genelor unice, cei care codifica transportatorii de nutrienti par sa fie printre cei mai frecvent transferati (Coelho si colab., 2013; Goncalves et al., 2016; Richards, 2011). Desi identificarea evenimentelor HGT poate fi simpla, avand in vedere esantionarea suficienta a liniilor aflate in studiu, referintele cu privire la fortele motrice evolutive din spatele HGT sunt adesea dificile si incerte, deoarece majoritatea evenimentelor HGT identificate sunt vechi. Cu toate acestea, dovezile disponibile sugereaza ca HGT-urile sunt adesea asociate cu adaptarea rapida la noile medii (Cheeseman et al., 2014; Gojkovic si colab., 2004; Qiu si colab., 2013; Richards si colab., 2011; Richards si Talbot, 2013).

In conformitate cu aceste constatari, am raportat recent asupra istoriei evolutive a unui transportor de fructoza specific unic, cu capacitate ridicata, Ffz1, care este intim asociat cu metabolismul fructofilic in drojdiile inmugurite ascomicetice (subphylum Saccharomycotina) (Goncalves et al., 2016) . Fructofilia este o trasatura relativ rara care consta in preferinta pentru fructoza fata de alte surse de carbon, inclusiv glucoza (Cabral si colab., 2015; Goncalves si colab., 2016; Sousa-Dias si colab., 1996). Evolutia FFZ1a implicat achizitia orizontala probabila a genei din ciuperci filamentoase (subphylum Pezizomycotina) de catre cel mai recent stramos comun (MRCA) al unei linii din Saccharomycotina, compusa pana acum in intregime din drojdii fructofile (Goncalves et al., 2016). Cele mai multe dintre cele aproximativ o suta de specii care formeaza aceasta increngatura ( Wickerhamiella si Starmerella genuri, precum si strans legate Candidaspecii), sunt asociate cu nisa florala si sunt adesea izolate de nectarul bogat in fructoza (Canto si colab., 2017; de Vega si colab., 2017; Lachance si colab., 2001). Interesant este ca bacteriile cu acid lactic fructofil, al caror metabolism a fost disectionat in detaliu, populeaza si nisa florala (Endo si colab., 2009; Endo si Salminen, 2013). S-a dovedit ca aceste bacterii cresc slab in ceea ce priveste glucoza, ceea ce poate fi explicat cel putin partial prin lipsa enzimelor lantului respirator si a activitatii alcoolului dehidrogenazei, deficiente care impiedica regenerarea NAD + in timpul cresterii acestui zahar, asa cum se arata in Lactobacillus kunkei(Maeno si colab., 2016). Spre deosebire de glucoza, fructoza poate fi folosita atat ca sursa de carbon, cat si ca acceptor de electroni pentru reoxidarea NAD (P) H (Zaunmuller si colab., 2006), oferind o explicatie a motivului pentru care este favorizata fata de glucoza. Prin urmare, fructofilia in bacteriile cu acid lactic pare a fi legata de homeostaza redox (Endo si colab., 2014). In drojdii, nu este inca clar cum poate fi benefic consumul preferential de fructoza, in parte deoarece, spre deosebire de bacteriile fructofile, drojdiile fructofile cresc puternic asupra glucozei cand este singura sursa de carbon si energie disponibila (Sousa-Dias et al., 1996; Tofalo et al., 2012). Lucrarile noastre anterioare au sugerat ca, desi pana acum s-a gasit o corelatie stricta intre prezenta Ffz1 si fructofilie la toate speciile cercetate (Cabral si colab., 2015; Goncalves et al., 2016; Leandro si colab.,FFZ1 a fost confirmat genetic la speciile fructofile Zygosaccharomyces rouxii (Leandro si colab., 2014), este foarte probabil sa existe cerinte suplimentare pentru fructofilie. Astfel, gena FFZ1 nu pare a fi suficienta pentru a conferi un caracter fructofil unei specii anterior glucofile.

Pentru a obtine o perspectiva asupra bazelor genetice ale fructophily in devenire drojdii si modul in care aceasta poate fi devenit evolutionist avantajoase, aici am folosit genomica comparativa pentru a identifica trasaturi, in plus fata de prezenta FFZ1 genei, care ar putea diferentia drojdii in fructophilic Wickerhamiella / Starmerella(W / S) clade, cu accent pe metabolismul central al carbonului. Rezultatele noastre sugereaza ca evolutia fructofiliei ar fi putut face parte dintr-un proces de adaptare la mediile bogate in zahar, care a inclus o remodelare profunda a fermentatiei alcoolice care implica achizitia de alcool dehidrogenaze bacteriene, care s-a dovedit a fi deosebit de importanta pentru metabolismul glucozei, si o invertaza, care este esentiala pentru asimilarea zaharozei. In general, am constatat o crestere a evenimentelor HGT derivate de bacterii in clada W / S in comparatie cu alte linii din Saccharomycotina (Marcet-Houben si Gabaldon, 2010), multe dintre ele par sa afecteze homeostazia redox.

Rezultate

Transportorul transferat pe orizontala Ffz1 este esential pentru fructofilie in St. Bombicola

Am raportat anterior achizitia unui transportor de fructoza de mare capacitate (Ffz1) prin HGT de catre MRCA a speciilor cu clade W / S. Acest transportor s-a pierdut in MRCA-ul Saccharomycotina si a fost transferat ulterior dintr-o specie inrudita cu Pezizomycotina in MRCA a cladei W / S, iar apoi din clada W / S la MRCA din genul Zygosaccharomyces (Goncalves et al. , 2016). Un rol putativ pentru Ffz1 in fructofilia in clada W / S a fost ipotezat pe baza proprietatilor sale cinetice (Pina si colab., 2004) si dovada ca este indispensabila pentru fructofilie in specia Z. rouxii indepartata filogenetic (Leandro si colab. , 2014). Pentru a testa aceasta ipoteza, a fost construit un mutant de stergere a FFZ1 la speciile W / S-clade tractabile geneticBombicola Starmerella . Profilul consumului de zahar in mediu YP suplimentat cu fructoza 10% (greutate / greutate) si glucoza 10% (greutate / greutate) (conditii in care fructofilia este aparenta, denumita in continuare mediu 20FG), a aratat ca comportamentul fructofil a fost eliminat complet in ffz1Δ mutant (Figura 1), similar cu ceea ce a fost gasit in rouxii Z. (Leandro si colab., 2014). O usoara crestere a ratei consumului de glucoza a fost, de asemenea, observata pentru mutantul ffz1∆ comparativ cu tipul salbatic cand culturile au fost cultivate in mediu 20FG (Figura 1).

Profilele privind consumul de zahar de tipul salbatic St. Bombicola (greutate) si ffz1 Δ.

Tulpinile au fost cultivate in YP suplimentate cu 10% (in greutate) fructoza si 10% (greutate / greutate) glucoza timp de 100 ore la 30 ° C cu aerare. Barele de eroare reprezinta abaterea standard a analizelor efectuate in duplicat in doua replici biologice.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.003

Genele de fermentare alcoolica in drojdiile cu clade W / S

Una dintre cele mai distincte caracteristici metabolice gasite in bacteriile fructofile care le-a distins de speciile non-fructofile strans legate a fost lipsa activitatii enzimatice necesare pentru producerea de etanol si regenerarea NAD (P) + concomitenta. Intr-o specie bine studiata, gena care codifica alcoolul dehidrogenaza bifunctionala (ADH) / aldehida dehidrogenaza (ALDH), in mod normal responsabila pentru productia de etanol, a fost absenta (Endo si colab., 2014), in timp ce la o alta specie a fost prezenta, dar proteina codificata a lipsit domeniul responsabil pentru productia de etanol (ADH), mentinand totodata domeniul care conduce reactia precedenta (Maeno si colab., 2016). Pe de alta parte, unele drojdii W / S-clade erau cunoscute anterior ca fiind producatori eficienti de alcooli sau lipide de zahar, in detrimentul etanolului (Magyar si Toth, 2011; Lee si colab., 2003a; Kurtzman si colab., 2010). Aceste observatii ne-au determinat sa investigam daca genele de alcool dehidrogenaza din drojdiile fructofile pot furniza, de asemenea, indicii referitoare la o relatie intre fructofilie si reciclarea cofactorului in drojdii, ca un prim pas spre dezvelirea altor determinanti metabolici ai fructofiliei.

In S. cerevisiae , gena ADH1 codifica enzima responsabila in principal de conversia acetaldehidei in etanol (de Smidt si colab., 2008). Prin urmare, am inceput prin preluarea omologilor din S. cerevisiae ADH1 de la genomii a sase specii de clasa W / S, precum si de la patru dintre rudele lor apropiate (Figura 2A) folosind tBLASTx. Printre speciile non-W / S-clade considerate, Candida infanticola(Kurtzman, 2007) ocupa o pozitie deosebit de informativa, intrucat a fost plasata filogenetic ca un grup al cladei W / S din specia noastra filogenie (figura 2A), fiind cea mai apropiata ruda a acesteia dintre speciile incluse in aceasta analiza. In prezent, nu a fost considerata parte a cladei W / S, deoarece ii lipseste transportorul Ffz1 (figura 2A) si nu a fost izolata pana acum de habitatele bogate in zahar (Kurtzman, 2007). In special, in timp ce distanta filogenetica intre toate speciile examinate si S. cerevisiae a fost similara, identitatea secventei proteice, valoarea E si valorile bitcore au notat faptul ca preziceau proteine ​​Adh1 prelevate de la speciile W / S-clade si C. infanticola ca rezultatele de top ale cautarea tBLASTx a fost mult mai putin asemanatoare cuS. cerevisiae interogare ADH1 decat genele recuperate de la omologii lor non-fructofili Sugiyamaella lignohabitans , Blastobotrys adeninivorans si Yarrowia lipolytica ( Figura 2B). Mai mult, cand secventele de proteine ​​Adh1 de la speciile W / S-clade si C. infanticola au fost utilizate ca interogari in cautarile BLASTp in baza de date NCBI non-redundant (nr), primele 1000 de accesari au constat in totalitate din proteine ​​bacteriene, in timp ce in secventele Adh1 de Su. lignohabitans , B. adeninivorans si drojdiile lipolitice Y. au fost folosite in mod similar ca interogari, primele 1000 de lovituri recuperate au fost proteinele fungice. Luate impreuna, aceste rezultate sugereaza ca specii si clade cu W / SC. infanticola au omologi Adh1 de origine bacteriana, spre deosebire de celelalte trei specii.

Probabilitatea maxima filogenia Saccharomycotina ( A ) si tBLASTx rezulta pentru gene de fermentare alcoolica ( B ).

( A ) Filogenia ML reprezentand relatia filogenetica dintre speciile W / S (evidentiata in albastru) si rudele apropiate (evidentiate in verde); alte linii Saccharomycotina au fost prabusite, conform indicatiilor. Numele speciilor sunt prescurtate asa cum este indicat in figura 2 – date sursa 1. Prezenta (stele negre) si absenta (stele albe) ale transportorului Ffz1 sunt indicate pentru fiecare specie. Rezultatele AI sunt prezentate ca numar de copaci in care grupul filogenetic cu bacterii a fost confirmat pentru fiecare specie testata in ramura respectiva (patrate albe) ( B ) rezultatele tBLASTx pentru cautarile ADH1 si PDC1 la speciile de clade W / S si rudele apropiate Su. lignohabitans , B. adeninivorans siY. lipolytica (evidentiata cu caractere aldine in figura 2A). Pentru fiecare gena si specie, graficul prezinta valoarea E (axa x), identitatea (axa y) si biografia (axa z, diametrul cercului) in raport cu ortologii S. cerevisiae . C. versatilis Proteinele Pdc de origine bacteriana sunt indicate de sagetile albastre.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.005

Prima etapa a caii de fermentare alcoolica consta in conversia piruvatului in acetaldehida, catalizata de piruvat decarboxilaza (Pdc) (Hohmann si Cederberg, 1990). Intrucat gena care codifica enzima „nativa” care catalizeaza a doua etapa, ADH1 , lipseste din genomele cu clasa W / S si pare sa fi fost „inlocuita” de o versiune bacteriana, am examinat ulterior daca genele PDC reflectau cumva particularitatile din evolutia ADH1 observata in clada W / S. In acest scop, secventa genei care codifica enzima responsabila in principal de conversia piruvatului in acetaldehida in S. cerevisiae,Pdc1, a fost utilizat pentru a-si prelua omologii in setul de specii identificate in figura 2A. In mod remarcabil, secventele de Pdc prelevate in acest mod din genomul speciilor W / S-clade si C. infanticola s-au dovedit, de asemenea, mai diferite pentru S. cerevisiae Pdc1 decat cele recuperate din cele trei specii ramase ne-fructofile, pe baza secventei identitate, valori E si bit-uri (Figura 2B). In conformitate cu observatiile pentru secventele Adh1, doua din cele trei secvente de Pdc identificate in C. versatilis , au fost mai strans legate de proteinele Pdc bacteriene decat de enzimele Pdc fungice (Figura 2B). Cu toate acestea, o cautare BLASTp folosind a treia secventa de Pdc din C. versatilisiar secventele Pdc ramase din speciile cu clade W / S ca intrebari, au aratat ca rudele lor cele mai apropiate erau proteine ​​fungice. In acest caz, valoarea E inferioara pare sa reflecte faptul ca ortologii Pdc gasiti la speciile W / S-clade si C. infanticola par sa apartina unei familii decarboxilaza care este inrudita filogenetic cu S. cerevisiae Aro10. In S. cerevisiae, Aro10 actioneaza preferential asupra substraturilor, altele decat piruvatul si nu este implicat in fermentatia alcoolica (Kneen si colab., 2011; Romagnoli si colab., 2012; Vuralhan si colab., 2005). Pentru a evalua mai bine relatia filogenetica intre secventele legate de Aro10 si Pdc1 si pentru a determina originea evolutiva a secventelor identificate in clada W / S, a fost reconstruita o filogenie maxima de probabilitate maxima (ML) folosind primele 500 de lovituri NCBI BLASTp folosind S. cerevisiae Pdc1 (CAA97573.1), ortolog Pdc putativ St. Bombicola si C. versatilisSecvente pdc de origine bacteriana aparenta ca interogari. Au fost de asemenea incluse secvente de Pdc putative din celelalte specii de clade W / S care nu sunt disponibile in baza de date NCBI Aceasta filogenie (fig. 3A si B) a confirmat gruparea secventelor W / S-clade cu proteine ​​Aro10 din ciuperci, ceea ce indica faptul ca PDC1 s-a pierdut in clada W / S. In plus, asa cum sugereaza rezultatele BLASTp, cele doua proteine ​​asemanatoare cu Pdc1 de la C. versatilis au fost grupate cu descarboxilaze piruvat bacteriene (figura 3C).

Filogenia ML a Pdc1 si Aro10.

A ) Filogenia ML a proteinelor asemanatoare cu Pdc1. Secventele W / S-clade si C. versatilis sunt indicate prin blocuri rosii. Ramurile cu suport pentru bootstrap mai mare de 90% sunt indicate prin puncte negre. Diferitele linii sunt reprezentate cu diferite culori de ramura (rosu pentru Saccharomycotina, albastru pentru bacterii si portocaliu pentru alte Ciuperci (adica non-Saccharomycotina). Clade evidentiate in gri (Aro10- si Pdc1) au fost atribuite in functie de pozitia filogenetica functionala proteine caracterizate de S. cerevisiae . ( B, C ) Filogenii ML potate care prezinta relatia filogenetica intre proteinele Aro10 cu clasa W / S si rudele lor apropiate in Saccharomycotina ( B ) si intre C. versatilisXenologii Pdc1 si cele mai apropiate descarboxilaze piruvate bacteriene ( C ). Pentru secvente cu clasa W / S, ID-ul proteinei este indicat inainte de numele prescurtat al speciilor.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.011

Toate genele glicolitice au fost examinate in acelasi set de specii si s-a dovedit ca toate sunt prezente si prezinta un nivel de similitudine preconizat cu proteinele de interogare S. cerevisiae (Figura 2 – date sursa 3). Acest lucru, impreuna cu faptul ca alte ansambluri de genom disponibile public inspectate din specii de clade W / S sunt de calitate foarte inalta (de exemplu, Wickerhamiella domercqiae JCM 9478, PRJDB3620 sau St. bombicola JCM 9596 de la RIKEN Center), face foarte putin probabil ca alcoolicul genele de fermentatie au fost ratate la speciile cu clade W / S din cauza acoperirii insuficiente sau a calitatii ansamblurilor genomului utilizate.

Identificarea altor gene de origine bacteriana in clada W / S

Analizele tBLASTx au relevat faptul ca genele ADH1 existente la speciile de clade W / S si, de asemenea, in C. infanticola au fost probabil transferate orizontal de la bacterii si acelasi lucru a fost observat pentru PDC1 in C. versatilis . Pentru a identifica alte gene de origine bacteriana in clada W / S care ar putea fi legate de metabolismul carbonului central si, prin urmare, de fructofilie, o conducta analitica sistematica cu un randament ridicat bazata pe scorul Alien Index (AI) (Alexander et al., 2016; Gladyshev si colab., 2008) au fost utilizate pentru detectarea HGT in grupul de specii definit anterior care cuprinde reprezentanti W / S-clade si rude apropiate in afara cladei.

Am gasit un numar considerabil mai mare de gene de origine bacteriana la speciile de clade W / S si, de asemenea, in C. infanticola, in comparatie cu cele doua specii mai indepartate in legatura cu clada W / S ( Su. Lignohabitans si B. adeninivorans , Figura 2A , Figura 2 – date sursa 2). In special, C. versatilis a afisat cel mai mare numar de gene putative derivate de HGT din bacterii (211), urmat de W. domercqiaecu 80 de gene pentru care se poate confirma gruparea filogenetica cu bacterii (Figura 2A). Avand in vedere ca toate speciile de clade W / S poseda un numar mai mare de gene derivate de HGT in comparatie cu rudele lor cele mai apropiate, este posibil sa existe o crestere a evenimentelor HGT in MRCA a cladei W / S. In conformitate cu aceasta ipoteza, am prezis ca va fi posibila identificarea unui numar semnificativ de gene care au fost retinute in mai mult de o specie de clade W / S. Intr-adevar, dupa implementarea pragurilor de aliniere (secvente proteice> 150 aminoacizi) si prabusirea filogeniilor replicate si a duplicarilor genice specifice de linie, a fost posibila definirea a 52 de grupari de ortologi cu reprezentanti in doua sau mai multe genome W / S-clade. Fara a exclude posibilitatea ca evenimente independente sa fi avut loc si in diferite specii,C. versatilis fiind specia care a pastrat cele mai multe gene de origine bacteriana (figura 2A). Dupa cum era de asteptat, ADH1 a fost prezent in acest grup (Figura 2 – date sursa 2). PDC1 a lipsit, deoarece au fost selectate doar grupuri de ortologi de origine bacteriana detectate in cel putin doua specii clade W / S, iar proteinele Pdc1 bacteriene au fost identificate doar la C. versatilis . Un alt grup de ortolog relevant pentru metabolismul fructozei gasit printre cele 52 definite in acest mod a fost SUC2, care codifica o invertaza in S. cerevisiae care hidrolizeaza extracelular zaharoza in fructoza si glucoza (Carlson et al., 1981). In S. cerevisiae , MAL si IMAs-a dovedit ca genele joaca un rol in hidroliza zaharozei (Deng si colab., 2014; Voordeckers et al., 2012), dar aceste gene sunt absente in genomul speciilor cu clade W / S, ceea ce inseamna ca invertaza transferata orizontal pare a fi singura enzima cu capacitate de hidrolizare a zaharozei codificata in genomii cladei W / S cercetate. Intr-un arbore filogenetic reconstruit folosind cele 200 de topuri superioare de phmmer la speciile W / S-clade Candida magnoliae (proteina ID 2301, a se vedea figura 2 – date sursa 2), un sprijin puternic pentru gruparea secventelor W / S-clade in secventele Acetobacteraceae SacC a fost observat (figura 4A si figura 4B). Un test de comparare a topologiei (Aproximativ nepartinit, AU) a sustinut, de asemenea, puternic ipoteza HGT (valoarea p = 4e − 07).

Filogenia ML a Suc2 fungic si a proteinelor bacteriene SacC.

A ) Filogenia ML a proteinelor Suc2 / SacC (cele mai mari 200 de lovituri de phmmer). Sunt evidentiate speciile cu clade W / S. Diferitele linii sunt reprezentate cu diferite culori de ramura (rosu pentru Saccharomycotina, albastru pentru bacterii si portocaliu pentru alte ciuperci (adica non-Saccharomycotina)). Ramurile cu suport pentru bootstrap mai mare de 90% sunt indicate prin puncte negre. ( B ) Filogenia ML potata a Suc2 care prezinta relatia filogenetica dintre clada W / S si Acetobacteraceae. Pentru secventele W / S, ID-ul proteinei este indicat inainte de numele speciilor prescurtate.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.012

Pentru a verifica imbogatirea putativa in alte functii proteice in restul genelor transferate, cele 52 de grupe de ortolog au fost ulterior referentiate cu Enciclopedia Kyoto a Genelor si Genomilor (KEGG), Genetica Ontologiei (GO) si adnotarile InterPro. In special, din 43 proteine ​​carora li s-a atribuit o functie moleculara GO, 16 au afectat homeostazia redox si au fost asociate cu activitatea oxidoreductazei (GO: 0016491 si GO: 0016616, 14 gene) si cu activitatea peroxidazei (GO: 004601, doua gene), in timp ce o adnotare BLAST KOALA (Kanehisa si colab., 2016) a indicat ca procesele biologice cel mai frecvent implicate au fost metabolismul aminoacizilor, metabolismul carbohidratilor si metabolismul cofactorilor si vitaminelor (figura 2 – date sursa 4). In special, unele dintre aceste gene par sa fi suferit mai multe duplicari intraspecifice,

Evolutia genelor alcool dehidrogenazei la speciile cu clade W / S

Am remarcat faptul ca, pe langa ADH1 , alte gene de alcool dehidrogenaza par sa fi fost dobandite orizontal de specii de clade W / S (Figura 2 – date sursa 4), inclusiv de ortologii putativi ADH6 si SFA1 , care pot participa si la fermentatia alcoolica in S. cerevisiae (Drewke si colab., 1990; Ida si colab., 2012). In toate cazurile, cu exceptia SFA1,ortologii „nativi” din drojdie par sa se fi pierdut in genomii cu clade W / S. Acest lucru ar putea implica faptul ca productia de etanol este condusa de alcool dehidrogenaze de origine bacteriana la speciile cu clade W / S. Pentru a afla mai multe despre istoria evolutiva a acestor gene, s-au efectuat analize filogenetice detaliate pentru Adh1 si Adh6, pentru care filogeniile cu probabilitatea maxima au fost reconstruite folosind cele mai bune lovituri ale filmerelor obtinute folosind proteinele St. bombicola Adh1 si Adh6 ca interogari.

Arborele Adh1 rezultat (figura 5A) a inclus secvente proteice atat din bacterii cat si din fungi. Toate speciile cu clade W / S sunt grupate cu un sprijin puternic cu proteinele Acetobacteraceae (Proteobacteria) Adh1 (Figura 5A si Figura 5B). In cadrul clusterului Adh1 W / S-clade, relatiile filogenetice generale au fost in concordanta cu relatiile asteptate dintre specii (Figura 2A), ceea ce sugereaza ca a avut loc un singur eveniment HGT in MRCA al acestei clade. Testele de comparare a topologiei (AU) au sustinut puternic evenimentul Adh1 HGT la clada W / S (valoarea p = 8e − 03), adaugandu-se la dovezile puternice ale HGT furnizate de ramura sustinuta puternic care clusterizeaza xenologii cu clasa W / S cu bacterii si rezultatele AI. Secvente Adh1 din C. infanticolade asemenea, grupate cu cele ale proteinelor de origine bacteriana. Cu toate acestea, cele doua secvente Adh1 de la C. infanticola nu sunt similare cu cele ale cladei W / S (Figura 5C), asa cum s-ar putea astepta daca un singur eveniment HGT ar fi responsabil pentru achizitia genei ADH1 in ambele linii. Aceste secvente s-au grupat in schimb, desi cu un suport slab, cu secvente Adh1 din Lactobacillales si Enterobacteriales indepartate (Figura 5C), ceea ce implica faptul ca un eveniment HGT independent ar fi putut avea loc in linia C. infanticola . Cu toate acestea, testele de topologie nu au sustinut puternic o origine independenta pentru proteinele W / S si C. infanticola Adh1 (valoarea p = 0,073).

Figura 5 cu 3 suplimente vezi toate

ML filogenia proteinelor fungice si bacteriene Adh1.

( A ) Filogenia ML a proteinelor Adh1 (top 4000 hit-uri). Sunt evidentiate speciile de clade W / S si C. infanticola . Diferitele linii sunt reprezentate cu diferite culori de ramura (rosu pentru Saccharomycotina, albastru pentru bacterii si portocaliu pentru alte ciuperci (adica non-Saccharomycotina)). Ramurile cu suport pentru bootstrap mai mare de 90% sunt indicate prin puncte negre. Liniile slab reprezentate (<10 secvente) sunt prezentate in gri. ( B, C ) Filogenii putate de ML ale Adh1 care prezinta relatia filogenetica dintre clada W / S si Acetobacteraceae ( B ) si intre C. infanticola si alte grupuri de bacterii ( C). Pentru secvente cu clasa W / S, ID-ul proteinei este indicat inainte de numele prescurtat al speciilor.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.014

O filogenie Adh6 ML extinsa (Figura 6A) a fost reconstruita cu cele 10 000 de topuri superioare pentru a arata ca secventele W / S-clade sunt intr-adevar ortologi Adh6. In aceasta filogenie, secventele W / S-clade sunt grupate cu un suport puternic (> 95%) cu secvente de Proteobacteria Adh6, in cadrul unui grup mare care cuprinde, de asemenea, proteine ​​Adh6 fungice cunoscute. In mod remarcabil, in timp ce secventele Adh1 W / S-clade grupate cu cele ale Acetobacteraceae (Figura 5A si Figura 5B), secventele Adh6 sunt mai strans legate de cele ale altor familii de bacterii, dupa cum se evidentiaza in Figura 6B. Cautarea phmmer nu a reusit sa descopere secvente Adh6 in proteomul C. infanticola . Absenta unui ortolog ADH6 a fost confirmata in continuare printr-o cautare tBLASTx impotriva C. infanticolagenom folosind secvente Adh6 atat de la S. cerevisiae (KZV09178.1) cat si din St. bombicola ca intrebari. Acest rezultat sugereaza ca atat ADH1 cat si ADH6 s-au pierdut la un stramos al C. infanticola si al cladei W / S. Interesant, ADH6 xenologs au fost aparent duplicate de mai multe ori in cadrul fiecarei specii W / S-clade (Figura 6A, 6B si Figura 2-sursa de date 4) si bacillaris Starmerella si C . magnolia are cel mai mult paraoguri (patru in total).

ML Filogenia proteinelor Adh6.

( A ) Filogenia a fost construita cu cele 10.000 de topuri superioare folosind Sf. Bombicola Adh6 ca interogare (cu caractere aldine, Panoul B). Au fost eliminate secventele cu o asemanare mai mare de 80%. Ramurile cu suport pentru bootstrap mai mare de 90% sunt indicate prin puncte negre. Liniile slab reprezentate (<10 secvente) sunt afisate in gri. Diferitele linii sunt reprezentate cu diferite culori de ramura (rosu pentru Saccharomycotina, albastru pentru bacterii si portocaliu pentru alte ciuperci (adica non-Saccharomycotina)). Secventele asemanatoare cu ADH1 au fost prabusite conform indicatiilor. ( B) Filogenie ML putata care prezinta relatia filogenetica intre secventele Adh6 din clada W / S si rudele lor bacteriene cele mai apropiate. Pentru secvente cu clasa W / S, ID-ul proteinei este indicat inainte de numele prescurtat al speciilor.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.018

Proprietatile cinetice ale alcoolului dehidrogenazelor de origine bacteriana la speciile cu clade W / S

Achizitia alcoolului dehidrogenazelor bacteriene de catre drojdiile cu clade W / S ar fi putut fi determinata de beneficiile putative oferite de o enzima cu caracteristici cinetice care ofera un anumit avantaj ca enzima „nativa” lipsea, probabil, sau, alternativ, de necesitatea restabilirii fermentatiei alcoolice dupa un eveniment de pierdere ancestrala, posibil in legatura cu adaptarea la un nou mediu. Pentru a ajuta la elucidarea acestui lucru si tinand cont si de legatura dintre activitatea Adh si fructofilie in bacterii, ne-am propus sa expunem diferentele functionale putative intre xenologii Adh gasiti in clada W / S si enzimele Adh „native”. Mai exact, am comparat activitatea de alcool dehidrogenaza (Adh) in trei specii de clade W / S, in drojdia stransa B. adeninivorans , si in speciile model S. cerevisiae, precum si intr-o specie de drojdie fructofila inrudita indepartata Zygosaccharomyces kombuchaensis . Toate speciile de clade W / S testate au fost capabile sa utilizeze etanolul ca sursa de carbon si energie si au un comportament negativ Crabtree atunci cand cresc pe zaharuri, ceea ce inseamna ca productia de etanol in culturile de loturi aerate incepe doar atunci cand densitatile celulare sunt foarte mari, limitand disponibilitatea oxigenului (de obicei OD640 nm 30, ~ 5-10 g / L etanol in St. bombicola ).

La toate speciile non-W / S-clade testate, a fost observata cu usurinta activitatea Adh dependenta de NADH, dar nu a fost detectata nicio activitate Adh dependenta de NADPH (Figura 5 – supliment de figura 2A), in conformitate cu informatiile disponibile referitoare la enzimele de drojdie ( Cho si Jeffries, 1998; Dashko si colab., 2014; Ganzhorn si colab., 1987; Leskovac si colab., 2002). Dimpotriva, toate speciile de clade W / S testate ( St. bombicola , C. magnoliae si St. bacillaris ) au prezentat activitate Adh atunci cand fie NADH fie NADPH au fost adaugate la amestecul de reactie (Figura 5 – fig. Supliment 2B). De fapt, desi ambii cofactori ar putea fi folositi pentru conversia acetaldehidei in etanol, a existat o afinitate mai mica pentru substratul (Km mai mare) pentru activitatea dependenta de NADPH in St. bombicola(Figura 5 – supliment de figura 2C). Interesant este ca in Acetobacter pasteurianus o specie bacteriana din Acetobacteraceae, aceeasi familie ca probabil donatorul de W / S-clade Adh1, s-a descoperit ca activitatea de alcool dehidrogenaza depinde de NADH, desi nu este clar daca NADPH a fost testat si ca cofactor. (Masud si colab., 2011).

Disectia genetica a fermentatiei alcoolice in Starmerella bombicola

In S. cerevisiae, s-a aratat ca enzimele paralogene Adh1, Adh2, Adh3 si Adh5 contribuie in grade diferite la conversia inter-etanol si acetaldehida intr-un mod dependent de NADH. Desi participarea lor la fermentatia alcoolica nu este substantiala, asa cum se poate deduce din lipsa activitatii detectabile (dependente de NADP +) in extractele de celule brute de S. cerevisiae (Figura 5 – supliment de figura 2A), Adh6 si Adh7 pot, in principiu, sa catalizeze acest tip de reactie, folosind NADPH in loc de NADH (de Smidt si colab., 2008). Deoarece atat ADH1, cat si ADH6-la fel ca genele sunt prezente in genomurile tuturor speciilor de clade W / S studiate, nu a fost clar care enzima (de tip Adh1 sau de tip Adh6) a fost responsabila pentru conversia inter-dependenta de NADPH de etanol si acetaldehida observata in W / S-clade specii. Pentru a elucida acest lucru si pentru a evalua impactul alcoolului deshidrogenazelor asupra metabolismului, s-au construit trei mutanti de stergere in St. bombicola (adh1 , ad6a∆ si adh6b∆ ). In timpul cresterii aerate, stergerea ADH1 (adh1∆) nu parea sa afecteze semnificativ ratele de crestere specifice ale glucozei sau fructozei in comparatie cu tipul salbatic (Figura 5 – supliment de figura 3A). Cu toate acestea, am observat o scadere de cinci ori a productiei de etanol (Figura 7A) si absenta cresterii etanolului ca sursa exclusiva de carbon si energie in mutantul AD1 (Figura 7 – suplimentul de figura 1). Desi a fost produs un anumit etanol, nu a fost detectata nicio activitate Adh in extractele fara celule ale mutantului adh1 atunci cand a fost utilizat fie NADH, fie NADPH (Figura 5 – supliment suplimentar cu figura 2E). Aceste rezultate sugereaza ca Adh1 este principala enzima folosita in fermentatia alcoolica din St. Bombicolasi, prin urmare, probabil accepta atat NADH, cat si NADPH ca cofactori. Am prezis ca, daca enzimele Adh1 cu clasa W / S ar fi utilizate in principal in reciclarea NADPH, ceea ce nu apare in mod normal in drojdii, in absenta sa, se asteapta o compensare in alte reactii de regenerare NADP +. Daca dimpotriva, enzimele Adh1 cu clan W / S au fost utilizate in principal in reciclarea NADH, s-ar observa cresterea compensatorie a unei reactii producatoare de NAD +. In conformitate cu preferinta cofactorului masurata in extractele de celule, scaderea semnificativa a randamentului de etanol pare a fi contrabalansata de o crestere concomitenta a productiei de glicerol (Figura 7A), similar cu ceea ce s-a observat in mutantul S. cerevisiae adh1∆ (de Smidt et al., 2012). Mai mult, cresterea adh1∆mutant cultivat pe mediu de crestere identic, dar in conditii de aerare limitata, a fost grav afectat (figura 5 – supliment de figura 3B). Luate impreuna, aceste observatii sugereaza cu tarie ca Adh1 joaca un rol important in homeostazia redox, si anume in regenerarea NAD + in absenta oxigenului, deoarece, in mod similar cu S. cerevisiae , formarea de glicerol in St. bombicolaeste probabil o reactie de regenerare a NAD +. In concordanta cu aceasta ipoteza, nu am detectat activitatea de glicerol dehidrogenaza dependenta de NADP + in extractele fara celule (Figura 5 – supliment de figura 2D), iar in cel putin o specie cu clan W / S, aceasta reactie a fost dependenta de NADH ( Van Bogaert si colab., 2008). In schimb, productia de manitol, care este o reactie de regenerare a NADP + (Lee si colab., 2003b), a fost redusa semnificativ in mutantul ADH1 (Figura 7A).

Productia de metaboliti si consumul de zahar in tipul salbatic St. Bombicola (in greutate) si mutantii de stergere ( adh1Δ, adh6aΔ, adh6bΔ si aro10Δ ).

( A ) Randament de etanol, glicerol si manitol determinat dupa 72 de ore de crestere. ( B ) Procentul de zahar (fructoza si glucoza) consumat dupa 72 de ore de crestere. Valorile medii sunt reprezentate de liniile orizontale colorate. Testele au fost efectuate in duplicat in doua replici biologice. Toate tulpinile au fost cultivate in mediu 20FG la 30 ° C cu aerare. Sunt prezentate diferente semnificative statistic (un mod ANOVA, folosind corectia Bonferroni) intre mutantii in greutate si stergere pentru consumul de zahar si productia de metaboliti (* valoarea p <0,05; ** valoarea p <0,01; *** valoarea p <0,001 ). Valorile p suplimentare pentru alte comparatii in perechi sunt prezentate in Figura 7 – date sursa 1. ( C ) Profilul de consum de zahar din aro10∆ mutant crescut in mediu 20FG. Profilul de consum de zahar este, de asemenea, indicat pentru tulpina in greutate, asa cum este indicat in cheie si a fost raportat anterior in Figura 1. Barele de eroare reprezinta abaterea standard a analizelor efectuate in duplicat in doua replici biologice.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.019

Eliminarea fiecareia dintre cele doua ADH6 gene paraloage ( adh6aΔ si adh6bΔ mutantele) nu a afectat semnificativ productia de etanol (Figura 7A). Aceasta inseamna ca, desi unele dintre enzimele codificate de aceste gene ar putea fi implicate in producerea de etanol in absenta Adh1, cand Adh1 este functional, acestea nu sunt esentiale pentru metabolismul etanolului si sunt probabil implicate in principal in alte reactii metabolice. In cele din urma, pentru a stabili cum pot afecta perturbarile in fermentatia alcoolica preferinta relativa a St. bombicola pentru fructoza fata de glucoza, am monitorizat consumul ambelor zaharuri in culturi aerate de-a lungul timpului in adh1∆, adh6a∆ si adh6b∆mutanti. A existat o scadere semnificativa a consumului de zahar la mutantul ADH1 (figura 7B), dar fructofilia a fost inca observata la toti mutantii si a devenit si mai accentuata, deoarece lipsa de Adh1 a afectat consumul de glucoza mai mult decat la consumul de fructoza.

Ortologii de S. cerevisiae Pdc1, care catalizeaza primul pas pe calea fermentativa, au parut a fi absenti in genomul W / S-clade. Intrucat toate speciile de clade W / S investigate produc etanol, care necesita decarboxilarea prealabila a piruvatului in acetaldehida, rezulta ca rolul indeplinit in mod normal de Pdc1 in S. cerevisiae trebuie sa fi fost preluat de o alta enzima din drojdiile W / S-clade . Conform analizei noastre filogenetice, singurul candidat probabil sa-si asume aceasta functie ar fi produsul genei ARO10 (Figura 3A). Cu toate acestea, si desi prezinta o similaritate a secventei de aminoacizi cu Pdc1, S. cerevisiaeAro10 a aratat o afinitate extrem de scazuta pentru piruvat ca substrat (Kneen si colab., 2011). Prin urmare, pentru a stabili daca Aro10 indeplineste un rol in fermentatia alcoolica in drojdii W / S-clade, un ARO10 mutant de deletie ( aro10Δ ) a fost construita in St. bombicola . Acest mutant nu a reusit sa produca etanol, asa cum s-ar putea astepta in absenta completa a activitatii piruvat decarboxilazei (Figura 7A). In mod similar cu adh1Δmutant, a prezentat o productie crescuta de glicerol, dar spre deosebire de primele, a crescut considerabil mai lent decat tulpina de tip salbatic in conditii aerate (Figura 7C). Aceasta scadere s-a datorat probabil mai ales faptului ca absenta activitatii piruvat decarboxilazei afecteaza alte cai metabolice, pe langa fermentatia alcoolica, cum ar fi productia de acetat si acetoina (Flikweert si colab., 1996). Fenotipul observat in acest mutant a confirmat ca Aro10 este singura decarboxilaza implicata in fermentatia alcoolica din St. bombicola si ca, prin urmare, modificarea specificitatilor enzimatice a fost implicata si in remodelarea fermentatiei alcoolice in drojdiile cu clade W / S. Important, in mutarea aro10 , consumul de glucoza pare sa fie si mai grav afectat decat in ​​cel aladh1Δ mutant (Figura 7B) si, de fapt, glucoza a fost lasata toata, dar neatinsa chiar si dupa 120 de ore de crestere (Figura 7C), in timp ce fructoza a fost consumata aproape in totalitate.

Identificarea unei linii de drojdie lipsita de o gena ADH1

Studiul de fata descrie o serie de evenimente evolutive care afecteaza genele implicate in fermentatia alcoolica la toate speciile studiate pana acum in clada W / S, o linie de peste 100 de specii care sunt foarte indepartate in legatura cu S. cerevisiae . Se pot propune doua ipoteze alternative cu privire la ordinea evenimentelor care stau la baza remodelarii observate a caii fermentative. Atat datele noastre de genomica comparativa, cat si rezultatele noastre experimentale sugereaza ca pierderea de ortologi ADH1 si PDC1 „autohtoni” a precedat dobandirea omologilor bacterieni, ale caror functii existente par a fi similare cu rolurile indeplinite in mod normal de enzimele de fermentare alcoolica in drojdii. Cu toate acestea, in timp ce am gasit o specie in prezent plasata in afara cladei W / S (C. infanticola ) lipsita de PDC1 , care este in concordanta cu pierderea acestei gene dupa ce a precedat achizitia versiunilor bacteriene ale acestei gene de catre C. versatilis , toate speciile din analiza noastra aveau fie o versiune „nativa”, fie cea bacteriana a genei ADH1 . De fapt, toate genomele disponibile public pe intregul subphyl Saccharomycotina au cel putin un ortolog ADH1 . Remarcabil, secventializarea genomului Candida galacta (Figura 8) in contextul unui proiect distinct (Proiectul Y1000 + Secventiere a genomelor tuturor speciilor cunoscute de Saccharomycotina; http://y1000plus.org) (Hittinger et al., 2015) a aratat ca ii lipseste atat PDC1, cat si ADH1(Figura 8, Figura 2 – date sursa 3). Pozitia filogenetica a acestei specii sustine cu tarie ipoteza ca pierderea ADH1 nativ a precedat achizitia (probabil independenta) a versiunilor bacteriene ale genei de catre linia C. infanticola si de MRCA a cladei W / S.

Pierderea si achizitionarea genelor legate de metabolismul zaharului in clada W / S si a liniilor strans legate.

Relatia filogenetica intre speciile W / S si rudele apropiate sunt descrise pe baza filogeniei ML folosind acelasi set de date ca in figura 2A, dar cu adaugarea de C. galacta . Pentru fiecare dintre cele patru gene relevante: ADH1, ADH6, SUC2 si PDC1 , prezenta, absenta si originea nativa sau bacteriana a ortologilor gasiti in genomii de crenaj cognitiv sunt afisate pentru fiecare specie langa ramura respectiva a copacului. Fiecare gena este reprezentata de cercuri cu culori linii diferite (albastru pentru FFZ1 studiat anterior (Goncalves et al., 2016), portocaliu pentru ADH1 , rosu pentru ADH6 , galben pentru PDC1 si violet pentru SUC2). Pentru xenologi, diferitele linii de donatori bacterieni previzionate sunt notate prin diferite culori de umplere, asa cum este indicat in cheie.

porno download http://shopsamslater.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/
step mother porno http://ultralightblimp.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/filme-porno/lesbiene
porno in socks http://gongaga.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/filme-porno/masturbare
solo porno http://webcourse.biz/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/filme-porno/negrese
animal porno http://cityofchehalis.us/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/filme-porno/pornhub
filmari porno http://fleshjackcity.net/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/filme-porno/hd
porno ful hd http://newenglandbeerfest.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/barmanita-penetrata-anal-de-un-hot-de-culoare
free video porno http://portabreezefan.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/violata-de-ginelocog-in-timpul-anesteziei
porno rusesti http://clkoptout.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/sora-vitrega-fortata-de-fratele-ei-pe-terasa
filme porno asa akira http://hmiindustriesinc.net/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/sexul-hentai-e-cel-mai-excitant
porno cu maimute http://mailacheck.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/ii-rupe-jurnalul-si-dupa-o-penetreaza
porno cu ponei http://processservertv.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/bunicul-ei-o-fute-in-timp-ce-curata-podeaua
filme porno cu fete http://airforcesystem.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/asa-mama-buna-mai-rar
film online porno http://jameskelrod.net/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/tatic-obrzanic-isi-face-fata-sa-planga
porno x hamster http://fourchangeenergy.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/mama-vitrega-indragostita-de-fiul-ei
filme porno cu milfe http://worldsgreatestwines.biz/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/secretara-fortata-de-sef-pentru-ca-a-intarziat
filme porno bz http://capecodpiano.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/o-invata-cum-sa-si-pedepseasca-prietenele-lezbiene
porno gratis cu blonde http://netscalability.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/doica-devine-interesata-de-pula-tanarului
porno 100 http://ceodb.com/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/bruneta-futabila-stie-sa-faca-atmosfera
clisma porno http://healthesports.org/__media__/js/netsoltrademark.php?d=adult69.ro/gaura-pizdii-e-foarte-tentanta-pentru-lezbiene

Pentru speciile cu clade W / S, este indicat si numarul de paraoghi care se gasesc in genomul proiectului cognat. Pierderile de gene (cruce) si evenimentele HGTs (sageti) sunt indicate in copac folosind aceleasi coduri de culoare.

https://doi.org/10.7554/eLife.33034.023

Invertaza de origine bacteriana este esentiala pentru asimilarea zaharozei in St. bombicola

Rezultatele noastre de pana acum sunt in concordanta cu ipoteza conform careia cresterea HGT observata in MRCA a cladei W / S este legata de adaptarea sa la mediul cu continut ridicat de zahar din nisa florala, asa cum este exemplificat prin achizitia transportorului de fructoza Ffz1. din ciuperci filamentoase si prin reaprovizionarea probabila a fermentatiei alcoolice care implica HGT pentru alcool dehidrogenaza si modificarea specificitatii enzimei (a Aro10). Achizitia unei invertaza bacteriene ( sacC)  (Martin si colab., 1987) de catre o linie lipsita de aceasta enzima pivota pentru metabolismul zaharozei este, de asemenea, in conformitate cu aceasta ipoteza, deoarece majoritatea nectarelor florale sunt foarte bogate este zaharoza (Mittelbach et al., 2015 ; Canto si colab., 2017).

Pentru a evalua daca gena invertaza dobandita orizontal este intr-adevar responsabila pentru asimilarea zaharozei in clada W / S, a fost construita o mutanta de stergere a sacC (denumita in continuare denumita suc2∆ pentru a sublinia relatia functionala cu binecunoscuta gena SUC2 S. cerevisiae ). in Sf . Bombicola . Testele de crestere in mediu suplimentate cu zaharoza ca sursa exclusiva de carbon si energie, au aratat ca mutantii suc2∆ nu au putut sa creasca (Figura 4 – supliment de figura 1A), in timp ce tulpina de tip salbatic a atins densitati celulare mari. Mai mult, suc2∆mutantul nu a reusit sa consume cantitati masurabile de zaharoza, chiar si dupa 72 de ore (Figura 4 – supliment de figura 1A). In timpul cresterii tulpinii de tip salbatic pe zaharoza, scaderea concentratiilor de zaharoza a fost insotita de aparitia fructozei si a glucozei in mediul de crestere, sugerand cu tarie ca gena SUC2 transferata orizontal codifica o invertaza extracelulara (figura 4 – supliment suplimentar cu figura 1B) . Aceasta concluzie este in concordanta cu absenta aparenta a genelor care codifica transportorii de zaharoza in genomele cladei W / S analizate, ceea ce indica faptul ca zaharoza trebuie mai intai hidrolizata in afara celulei pentru a fi utilizata ca sursa de carbon si energie.

Discutie

Linia de drojdie numita aici clada Wickerhamiella / Starmerella (W / S) cuprinde mai multe specii care au atras anterior atentia datorita caracteristicilor metabolice neobisnuite. Cel mai proeminent exemplu este St. bombicola , o specie folosita pentru producerea sophorolipidelor, care sunt molecule amfipatice care sunt folosite ca biosurfactanti (Samad si colab., 2015; Takahashi et al., 2011). Bacilarii Starmerella se gasesc adesea in fermentatiile vinului si sunt cunoscuti pentru devierea unei fractiuni importante din fluxul sau de carbon catre productia de glicerol in loc de etanol (Englezos si colab., 2015). Candida magnoliaesa raportat ca este capabil sa produca cantitati mari de eritritol (Ryu si colab., 2000). Mai recent, am raportat ca fructofilia a fost o trasatura comuna importanta care a unit aceste specii si altele apartinand cladei W / S si am consubstantiat, de asemenea, o corelatie stricta intre prezenta transportorului Ffz1 si fructofilie. Aici, aratam ca prezenta transportorului Ffz1 este o conditie necesara pentru fructofilie in St. bombicola , asa cum s-a observat anterior in Z. rouxii(Leandro si colab., 2014). Accentul mai puternic pe productia de alcooli de zahar ca produsi secundari ai metabolismului in detrimentul etanolului parea sa fie o trasatura comuna intre speciile examinate (Lee si colab., 2003b; Ryu si colab., 2000), ceea ce ne-a condus la ipoteza ca preferinta acestor drojdii fata de fructoza a fost probabil sa faca parte dintr-o remodelare mai larga a metabolismului legata de adaptarea la mediile cu continut ridicat de zahar in care aceste drojdii prospera. Lucrarea de fata reflecta efortul nostru de a descoperi alte aspecte ale acestei adaptari folosind genomica comparativa ca punct de plecare.

Examinarea noastra a genelor dobandite din bacterii a aratat ca numarul de evenimente HGT de la bacterii in clada W / S si linia vecina (reprezentata de specia C. infanticola ), a depasit cu mult numarul de evenimente raportate pentru alte linii Saccharomycotina (Marcet- Houben si Gabaldon, 2010) si a fost, de asemenea, considerabil mai mare decat cele pe care le-am identificat la doua specii strans legate, dar filogenetic in mod clar in afara cladei W / S ( Su. Lignohabitans si B. adeninivorans ). Cel mai mare numar de evenimente HGT a fost detectat la cele mai devreme specii din clada W / S, C. versatilis, care impreuna cu semnalul filogenetic din genele care au fost dobandite prin HGT, sugereaza ca o crestere mare a achizitiilor a avut loc probabil in MRCA-ul cladei (Figura 2A). In conformitate cu acest model, majoritatea descendentilor au aruncat ulterior o mare parte din xenologii prezenti initial in stramosul comun. In conformitate cu aceasta ipoteza, a fost posibil sa se identifice 52 de grupari de ortolog xenolog care erau prezente in cel putin doua specii de clade W / S. Se pare ca, pe langa evenimentele HGT comune numai speciilor de clade W / S, evenimente suplimentare de HGT au avut loc in MRCA de C. infanticola si clada W / S deoarece, din inspectia filogeniilor construite pentru C. infanticola, cel putin sase gene de origine bacteriana aparenta la aceasta specie au, de asemenea, origine bacteriana in clada W / S. In timp ce linia donatorului bacterian pare sa fie destul de diferita intre C. infanticola si clada W / S pentru o gena ( ADH1 ), sugerand cu tarie ca au fost dobandite in evenimente separate, celelalte cinci gene au un stramos comun, aratand posibil catre un singur eveniment. In masura in care se poate evalua in prezent din productia conductei noastre de AI, genele derivate din HGT par sa fie specifice pentru C. infanticola. In plus, am observat ca setul de 52 de xenologi prezenti in cel putin doua specii de clade W / S existente sunt imbogatite pentru gene care codifica proteine ​​care afecteaza echilibrul redox in celula. De fapt, schimbarile fluxurilor prin caile metabolice principale au fost anterior aratate ca au un echilibru redox si stres oxidativ la drojdii (Gonzalez-Siso si colab., 2009), care este in concordanta cu ipoteza noastra care asociaza achizitia de gene bacteriene cu modificari adaptative in metabolism.

Cea mai izbitoare constatare cu privire la functia genelor transferate este remodelarea profunda a caii de fermentatie alcoolica omniprezenta folosita de drojdii pentru a transforma piruvatul in etanol cu ​​regenerarea concomitenta a NAD +. Prima etapa a caii, constand in conversia piruvatului in acetaldehida, este in mod normal catalizata de enzima Pdc1. Cu toate acestea, in majoritatea drojdiilor cu clade W / S, Pdc1 este absent. Aici, am furnizat dovezi genetice pentru o specie de clade W / S, St. bombicola, ca rolul Pdc1 a fost preluat de o decarboxilaza inrudita codificata in S. cerevisiae de catre gena ARO10 . In S. cerevisiae, fenilpiruvatul este substratul primar al Aro10, care leaga aceasta enzima de catabolismul aminoacizilor, mai degraba decat fermentatia alcoolica (Romagnoli si colab., 2012; Vuralhan si colab., 2005). Cu toate acestea, s-a demonstrat ca mutageneza directionata pe site a catorva site-uri selectate a fost capabila sa creasca considerabil afinitatea S. cerevisiae Aro10 pentru piruvat (Kneen et al., 2011), ceea ce sustine ideea ca aceasta schimbare a specificitatii substratului poate au aparut in mod natural in cursul evolutiei drojdiilor cu clade W / S. In mod intrigant, C. versatilis , ii lipseste, de asemenea, o gena PDC1 nativa, dar poseda doua gene de origine bacteriana care codifica ortologii PDC1 , care coexista cu ARO10.La aceasta specie, este posibil ca xenologii, si nu ARO10 , sa efectueze conversia piruvatului in acetaldehida.

Al doilea pas in fermentatia alcoolica este transformarea acetaldehidei in etanol, care este efectuata in S. cerevisiae in principal de Adh1. Din nou, genele ADH1 „native” au lipsit de la toate genomele W-S-clade examinate si se pare ca MRCA-ul cladei W / S a dobandit o gena ADH1 bacteriana , din care xenologii ADH1 existenti in toate W / S-uri existente au fost derivate speciile de clade examinate. O intamplare similara a fost detectata implicand pierderea ortologului „nativ” ADH6 , care codifica un alcool dehidrogenaza ramificata dependenta de NADPH si achizitionarea de ortologi bacterieni, desi liniatii donatorilor bacterieni ai ADH1 si ADH6xenologii par sa fie distinsi. Am aratat ca, in St. bombicola , xenologul ADH1 este absolut necesar pentru cresterea etanolului si este, de asemenea, responsabil in principal pentru fermentatia alcoolica, indeplinind astfel functiile indeplinite de doua enzime diferite in S. cerevisiae (unde Adh2 catalizeaza asimilarea etanolului). Cei doi xenologi ADH6 au jucat un rol minor, daca este cazul, in fermentatia alcoolica, in mod similar cu ceea ce se intampla in S. cerevisiae .

Toate rezultatele noastre sunt in concordanta cu ipoteza conform careia fermentatia alcoolica a fost pierduta pentru prima data intr-o linie ancestrala si ulterior a fost atinsa de drojdii W / S-clade prin achizitia orizontala de gene. Intr-un caz, o gena drojdie preexistenta ( ARO10) si-a modificat, de asemenea, specificitatile enzimatice pentru a se implica in fermentatia alcoolica. Pe de alta parte, nu a fost gasita nicio dovada pentru ipoteza alternativa care sa ateste ca achizitia a precedat pierderea, cum ar fi coincidenta in acelasi genom al Adh1 „native” si bacteriene sau un rol distinctiv pentru enzima bacteriana in metabolismul drojdiei, care ar putea au condus la fixarea versiunii bacteriene a Adh1. Pierderea si reincadrarea ulterioara a unei cai metabolice prin mai multe evenimente HGT au fost raportate anterior pentru algele rosii unicelulare.Flegrea Galdieria in care s-a produs pierderea masiva de gena concomitent cu adaptarea la o nisa specializata in stramosul comun al algelor rosii Cyanidiophytina (Qiu si colab., 2013). Liniile de dovezi care sustin un eveniment similar pentru fermentatia alcoolica in clada W / S sunt triplate, dupa cum urmeaza.

In primul rand, un aspect esential care sustine ipoteza „pierderii urmate de reinnoire” este identificarea unei linii de drojdie, aici reprezentata de C. galacta , care nu are un ortolog ADH1 , fie „nativ”, fie bacterian. Specia filogenia prezentata in figura 8 plaseaza aceasta specie aproape de C. infanticola, intr-o pozitie in concordanta cu predictia noastra pentru un reprezentant existent al unei linii Adh1 care dateaza inainte de achizitia genelor ADH1 bacteriene . In plus, cele doua gene care formeaza calea de fermentare alcoolica par sa se fi pierdut intr-o succesiune rapida, deoarece nu a fost gasit niciun gen care sa detina doar ADH1 „nativ” sau doar PDC1 „nativ”.gene. Acest lucru sugereaza, de asemenea, ca pierderea intregii cai pre-datate de achizitie de noi gene sau functii.

In timp ce xenologii ADH1 si ADH6 persista la toate speciile existente de clade W / S existente, xenologii PDC1 bacterieni , daca au fost intr-adevar dobanditi de catre MRCA-ul cladei, au fost ulterior pierduti la majoritatea speciilor. Este posibil ca aceste pierderi ipotezate sa fi avut loc pe masura ce Aro10 a evoluat pentru a indeplini functia Pdc1. C. versatilis , care este cea mai timpurie specie divergenta din clada W / S, este o exceptie notabila care poseda doi xenologi PDC1 in plus fata de ARO10 . De aici, C. versatilis pe de o parte, si restul speciilor de clade W / S, pe de alta parte, par sa reprezinte doua solutii distincte care restabileste activitatea decarboxilazei piruvate, care este o a doua observatie in conformitate cu pierderea genica fiind evenimentul ancestral.

Evaluarea noastra a performantei enzimelor Adh1 la speciile cu clade W / S constituie un al treilea argument in favoarea ipotezei „pierderii urmata de reinnoire”. Am aratat ca enzimele cl-W / S de origine bacteriana au o caracteristica potential avantajoasa in comparatie cu omologii lor de drojdie; ele sunt capabile sa regenereze atat NAD + cat si NADP +, in timp ce enzimele de drojdie accepta doar NADH ca cofactor. Cu toate acestea, cel putin in St. bombicola, eliminarea Adh1 a fost compensata printr-o crestere a formarii glicerolului, care este foarte probabil o reactie de regenerare a NAD + si nu a formarii de manitol, care regenereaza NADP +. Prin urmare, este rezonabil sa deducem ca xenologii Adh joaca un rol similar cu cel indeplinit in mod normal de enzimele native Adh. Mai mult, eliminarea completa a fermentatiei alcoolice, asa cum s-a observat in mutantul aro10Δ , a dus la o compensare si mai accentuata la nivelul productiei de glicerol.

In concluzie, avand in vedere dovezile prezentate aici, prezenta xenologilor implicati in fermentatia alcoolica in drojdiile cu clade W / S existente poate fi explicata cel mai bine prin necesitatea restabilirii fermentatiei alcoolice intr-o linie care o pierduse anterior. In acest caz, implicarea genelor bacteriene pare a fi fost circumstantiala si, eventual, o consecinta a disponibilitatii donatorului in acelasi mediu. Oportunitatea ecologica pentru schimbul orizontal de material genetic care sta la baza achizitiei de ADH1 bacterian pare sa fi existat de mult timp, intrucat proteinele Adh1 clade W / S sunt cele mai strans legate